利用凝膠層析介質(zhì)(固定相)交聯(lián)度的不同所形成的網(wǎng)狀孔徑的大小，在層析時(shí)能阻止比網(wǎng)孔直徑大的生物大分子通過(guò)。利用流動(dòng)相中溶質(zhì)的分子量大小差異而進(jìn)行分離的一種方法，稱之為排阻層析。如下圖所示
利用固定相載體上偶聯(lián)的亞胺基乙二酸為配基與二價(jià)金屬離子發(fā)生螯合作用，結(jié)合在固定相上，二價(jià)金屬離子可以與流動(dòng)相中含有的半胱氨酸、組氨酸、咪唑及其類似物發(fā)生特異螯合作用而進(jìn)行分離的方法，稱之為金屬螯合層析。如下圖所示
（8）反向?qū)游?reverse phase chromatography)
利用固定相載體上偶聯(lián)的疏水性較強(qiáng)的配基，在一定非極性的溶劑中能夠與溶劑中的疏水分子發(fā)生作用，以非極性配基為固定相，極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離不同極性的物質(zhì)的方法，稱之為反相層析。
（9）聚焦層析(focusing chromatography)
利用固定相載體上偶聯(lián)的載體兩性電解質(zhì)分子，在層析過(guò)程中所形成的pH梯度，并與流動(dòng)相中不同等電點(diǎn)的分子發(fā)生聚焦反應(yīng)進(jìn)行分離的方法，稱之為聚焦層析。 （10）灌注層析(perfusion chromatography)
利用剛性較強(qiáng)的層析介質(zhì)顆粒中具有的不同大小貫穿孔與流動(dòng)相中溶質(zhì)分子分子量的差異進(jìn)行分離的方法，稱之為灌注層析。 2. 常用層析技術(shù)
2.1 離子交換層析技術(shù)
是以離子交換纖維素或以離子交換葡聚糖凝膠為固定相，以蛋白質(zhì)等樣品為移動(dòng)相，分離和提純蛋白質(zhì)、核酸、酶、激素和多糖等的一項(xiàng)技術(shù)。 2.1.1 原理
在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽(yáng)離子基團(tuán)時(shí)，可換出陰離子，則稱為陰離子交換劑。如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纖維素。在纖維素上結(jié)合了DEAE，含有帶正電荷的陽(yáng)離子纖維素—O—C6 H14N+H，它的反離子為陰離子（如Cl-等），可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)陰離子進(jìn)行交換。當(dāng)結(jié)合陰離子基團(tuán)時(shí)，可置換陽(yáng)離子，稱為陽(yáng)離子交換劑，如羧甲基（Carboxymethy， CM）纖維素。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離
子（纖維素－O－CH2－COO一
），其反離子為陽(yáng)離子（如Na+等）,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽(yáng)離子進(jìn)行交換。
溶液的pH值與蛋白質(zhì)等電點(diǎn)相同時(shí)，靜電荷為0，當(dāng)溶液pH值大于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷。反之，溶液的pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，則氨基電離，蛋白質(zhì)帶正電荷。溶液的pH值距蛋白質(zhì)等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，蛋白質(zhì)的電荷越多。反之則越少。血清蛋白質(zhì)均帶負(fù)電荷，但各種蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷的程度有所差異，以白蛋白為**多，依次為?球 蛋白，β球蛋白和γ球蛋白
在適當(dāng)?shù)柠}濃度下，溶液的pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當(dāng)溶液的pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)被陽(yáng)離子交換劑所吸附。由于各種蛋白質(zhì)所帶的電荷不同。它們與交換劑的結(jié)合程度也不同，只要溶液pH值發(fā)生改變，就會(huì)直接影響到蛋白質(zhì)與交換劑的吸附，從而可能把不同的蛋白質(zhì)逐個(gè)分離開(kāi)來(lái)。
交換劑對(duì)膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無(wú)機(jī)鹽離子（如NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
兩者同時(shí)存在于一個(gè)層析過(guò)程中，則產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性的交換吸附。當(dāng)Cl一
的濃度大時(shí)，蛋白質(zhì)不
容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當(dāng)Cl一
濃度小時(shí)，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。因此，在離子交換層析中，一般采用兩種方法達(dá)到分離蛋白質(zhì)的目的。一種是增加洗脫液的離子強(qiáng)度，一種是改變洗脫液的pH值。pH值增高時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陽(yáng)離子化，隨之對(duì)陽(yáng)離子交換劑的吸附力減弱。pH值降低時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對(duì)陰離子交換劑的吸附。當(dāng)使用陰離子交換劑時(shí)，增加鹽離子，則降低pH值。當(dāng)使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)，增加鹽離子濃度，則升高溶液pH值。 2.1.2常用離子交換劑的種類與特性
（1）離子交換纖維素 離子交換纖維素的種類很多，**常用的是DEAE—纖維素和CM纖維素。由于劑型不同，其理化性質(zhì)和作用也有所差異。一般而言，微粒型要優(yōu)于纖維素型，因?yàn)槲⒘Ｐ褪窃诶w維素型的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提煉而成。它的交換容量大，粒細(xì)、比重大，能裝成緊密的層析柱，要求分辨力高的實(shí)驗(yàn)可用此型纖維素。
離子交換纖維素的優(yōu)點(diǎn)為：①離子交換纖維素為開(kāi)放性長(zhǎng)鏈，具有較大的表面積，吸附容量**大；②離子基團(tuán)少，排列稀疏，與蛋白質(zhì)結(jié)合不太牢固，易于洗脫；③具有良好的穩(wěn)定性，洗脫劑的選擇范圍廣。
（2）離子交換交聯(lián)葡聚糖 離子交換交聯(lián)葡聚糖也是廣泛使用的離子交換劑，它與離子交換纖維素不同點(diǎn)是載體不同。
離子交換交聯(lián)葡聚糖有如下優(yōu)點(diǎn)：①不會(huì)引起被分離物質(zhì)的變性或失活；②非特異性吸附少；③交換容量大。
離子交換葡聚糖的選用，一般根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般選A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜選用A25和C25。 2.1.3 試驗(yàn)方法
陰離子交換劑與陽(yáng)離子交換劑的裝柱和層析過(guò)程基本相同。交聯(lián)葡聚糖的預(yù)處理只需充分溶脹和平衡，不需要除去細(xì)粒碎片和酸堿處理。其他步驟也基本同離子交換纖維素。
（1）劑型的選擇 根據(jù)蛋白質(zhì)在所用緩沖液pH值下帶電荷的種類選擇，如pH高于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，應(yīng)選陰離子交換劑，反之應(yīng)選陽(yáng)離子交換劑。一般情況下，DEAE-纖維素用于分離酸性蛋白，而CM纖維素用于分離堿性蛋白質(zhì)。 下面以DEAE-纖維素操作為例，介紹試驗(yàn)方法
（2）膨脹活化 此步的目的在于除去雜質(zhì)，暴露DEAE-纖維素上的極性基團(tuán)。DEAE-纖維素的用量則根據(jù)柱容積的大小和所需過(guò)柱樣品的量來(lái)決定。一般是1.0g DEAE-纖維素相當(dāng)于6ml～8ml柱床體積。
稱取所需的量，撒于0.5 mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纖維素干粉約需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不時(shí)攪拌。抽濾（以布氏漏斗加兩層濾紙或尼龍紗布抽濾），以蒸餾水洗滌，再抽濾，直**濾液近中性為止，再將纖維素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同樣抽濾液**近中性。再將纖維素浸于0.5 mol/L NaOH液中，同樣處理，洗**中性。
（3）平衡 將DEAE—纖維素放入0.0l mol/L pH 7. 4 PB液中（即起始緩沖液），靜止1 h，不時(shí)攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復(fù)幾次**傾出液體的pH值與加入的PB液的pH值相近時(shí)為止。
（4）裝柱 層析柱的選擇要大小、長(zhǎng)度適當(dāng)。一般而言，柱長(zhǎng)和柱直徑之比為10︰1～20︰1，柱的內(nèi)徑上下要均勻一致。用前將層析柱在清潔液內(nèi)浸泡處理24 h，然后依次用常水、蒸餾水、起始緩沖液充分洗滌。
（5）上樣 要層析的樣品shou先必須用起始緩沖液（4℃）平衡過(guò)夜，中間可換液數(shù)次。將柱的上端打開(kāi)，用吸管將纖維素柱上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進(jìn)入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂纖維素表層。擰開(kāi)下端的螺旋夾，使樣品進(jìn)入交換劑中，快要進(jìn)完時(shí)，加1 ml～2 ml緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。
樣品的加量與DEAE—纖維素有一個(gè)**適比的關(guān)系，超過(guò)這個(gè)比值，吸附就不完全，直接影響到分離的純度。經(jīng)過(guò)粗提的?—球蛋白50 mg～100 mg，用干重約4 g DEAE－纖維素裝柱分離，可獲得理想結(jié)果。
（6）洗脫 對(duì)于陰離子交換劑而言，洗脫的辦法是使pH逐漸降低，而離子濃度逐漸升高。一般的辦法，是穩(wěn)定一個(gè)因素而改變另一個(gè)因素洗脫。洗脫可采用分段洗脫和連續(xù)洗脫法，前者較實(shí)用，后者較準(zhǔn)確。
（7）洗脫液的收集 利用自動(dòng)分步收集器收集，并以20%磺基水楊酸測(cè)試，當(dāng)?shù)鞍滓合聛?lái)時(shí)，開(kāi)始分管收集，**無(wú)蛋白液為止。
（8）交換柱的再生 將使用過(guò)的DEAE－纖維素移入燒杯中，用2 mol/L NaCl液浸泡，抽濾并洗滌數(shù)次。如不立即使用，可加1/10 000的疊氮鈉防腐，保存于4℃冰箱中。使用時(shí)，再以堿－酸－堿處理。
2.2 凝膠層析
凝膠層析又稱為分子篩層析或凝膠過(guò)濾。具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用**廣，商品名是sephadex型號(hào)很多，從G10到G200，它的主要應(yīng)用范圍是：①分級(jí)分離各種抗原與抗體；②去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片；③分析血清中的免疫復(fù)合物；④分子量的測(cè)定。 2.2.1 原理 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質(zhì)，當(dāng)帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于它們的分子量不同而表現(xiàn)出速度的快慢，在緩沖液洗脫時(shí)，分子量大的物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運(yùn)動(dòng)，而分子量小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠孔內(nèi)進(jìn)行“繞道”運(yùn)行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達(dá)到分離的目的。 2.2.2 葡聚糖凝膠的種類與性能 葡聚糖又名右旋糖酐，在它們的長(zhǎng)鏈間以三氯環(huán)氧丙烷交聯(lián)劑交聯(lián)而成。葡聚糖凝膠具有很強(qiáng)的吸水性，交聯(lián)度大，吸水性小，相反交聯(lián)度小，吸水性大。商品名以SephadexG表示，G值越小，交聯(lián)度越大，吸水性越小，G值越大，交聯(lián)度越小，吸水性就越大，二者呈反比關(guān)系，G值大約為吸水量的10倍。由此可以根據(jù)床體積而估算出葡聚糖凝膠干粉的用量。
G25、G50有四種顆粒型號(hào)：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、細(xì)（20µ~80µ）和超細(xì)（10µ~40µ）。G75～G200又有兩種顆粒型號(hào)：中（40µ～120µ），超細(xì)（10µ～40µ）。顆粒越細(xì)，流速越慢，分離效果越好。 2.2.3 試驗(yàn)方法
（1）凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號(hào)的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。
（2）凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過(guò)量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號(hào)的凝膠而定。如下表所示
凝膠量與型號(hào)和層析柱大小與規(guī)格及凝膠用量
為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20 min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。
（3）裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí)，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長(zhǎng)一些，分離效果好，但柱太長(zhǎng)，則延長(zhǎng)分離時(shí)間，樣品也稀釋過(guò)度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過(guò)細(xì)，會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對(duì)于除鹽來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰5～1︰25；對(duì)于純化蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰20～1︰100。 裝柱過(guò)程基本同離子交換層析柱。
（4）加樣與洗脫 樣品體積不宜過(guò)多，**好為床體積的1％～5%，**多不要超過(guò)10%。樣品濃度也不宜過(guò)大，濃度過(guò)大粘度大，分離效果差，一般不超過(guò)4%。
洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1 mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14 mol/L NaCl）和0.1 mol/L pH8.0 Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14 mol/L NaCl）。
（5）洗脫液收集 同離子交換層析。
（6）凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來(lái)之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種：
A 在液相中保存**方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02% N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法**少可以保存半年以上。
B 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。
C 長(zhǎng)期不用者，**好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，**后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。
2.3 親和層析 2.3.1 原理
親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開(kāi)，達(dá)到分離提純的目的。
此法具有高效、快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。 2.3.2載體的基本要求和選擇
理想的載體應(yīng)具有下列基本條件：①不溶于水，但高度親水；②惰性物質(zhì)，非特異性吸附少；③具有相當(dāng)量的化學(xué)基團(tuán)可供活化；④理化性質(zhì)穩(wěn)定；⑤機(jī)械性能好，具有一定的顆粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，**好為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使大分子能自由通過(guò)；⑦能抵抗微生物和醇的作用。
可以做為固相載體的有皂土、玻璃微球、石英微球、羥磷酸鈣、氧化鋁、聚丙烯酰胺凝膠、淀粉凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素和瓊脂糖。在這些載體中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特異性吸附。纖維素的非特異性吸附強(qiáng)。聚丙稀酰胺凝膠是目前的**優(yōu)良載體。
瓊脂糖凝膠的優(yōu)點(diǎn)是親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不受細(xì)菌和酶的作用，具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在緩沖液離子濃度大于0.05 mol/L時(shí)，對(duì)蛋白質(zhì)幾乎沒(méi)有非特異性吸附。瓊脂糖凝膠極易被溴化氫活化，活化后性質(zhì)穩(wěn)定，能經(jīng)受層析的各種條件，如0.1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl處理2 h~3 h及蛋白質(zhì)變性劑7 mol/L尿素或6 mol/L鹽酸胍處理，不引起性質(zhì)改變，故易于再生和反復(fù)使用。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
瓊脂糖凝膠微球的商品名為Sepharose，含糖濃度為2%、4%、6%時(shí)分別稱為2B、4B、6B。因?yàn)镾epharose 4B的結(jié)構(gòu)比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B應(yīng)用**廣。 2.3.3 試劑與配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（劇毒） 3．抗原或抗體
4．1 mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水**1 000 ml。 5．0.1 mol/L NaHCO3 6．2 mol/L NaOH
7．0.01 mol/L pH7.4 PBS
0.2 mol/L Na2HPO4 38.0 ml 0.2 mol/L Na2HPO4 162.0 ml NaCl 32.76 g 加水**4 000 ml。 8．0.1 mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl緩沖液 甘氨酸15.01 g加水**1 000 ml，取此液，加0.2 mol/L HCl 84 ml加水166 ml共500 ml。 9．7 mol/L尿素
10．0.2 mol/L NaHCO3,（含0.1 mol/L NaCI） 1 mol/L NaHCO3 100.00 ml NaCl 2.93 g 加水**500.00 ml。 2.3.4 實(shí)驗(yàn)方法 1．瓊脂糖活化 ⑴ 取20 ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1 mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗滌，立即轉(zhuǎn)入100 ml燒杯中，冰浴置于磁力攪拌器上。 ⑵ 在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取2 g溴化氰，加水20 ml溶解，然后倒入瓊脂糖中，小心滴加2 mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反應(yīng)10 min。在1 min~2 min迅速調(diào)整pH為8.0～11.0維持10 min。 ⑶ 將活化的瓊脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250 ml冷的0.1 mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。
2．偶聯(lián)蛋白 20 ml 4B液體相當(dāng)于一半的固相載體。 ⑴ 事先將需偶聯(lián)的抗原（或抗體）蛋白200 mg置于0.1 mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析數(shù)小時(shí)(一般偶聯(lián)量為10~30 mg/g載體)。
⑵ 將活化的瓊脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5 min內(nèi)，從抽洗到偶聯(lián)），4℃緩慢攪拌過(guò)夜，使蛋白與活化的瓊脂結(jié)合。
3．裝柱 ⑴ 選柱：不宜過(guò)大，一般以1.5×15 cm的層析柱可裝偶聯(lián)蛋白的瓊脂糖約30ml。 ⑵ 裝柱：將已與蛋白偶聯(lián)的瓊脂糖裝入層析柱內(nèi)，擰緊下口夾，讓其下沉，數(shù)分鐘后松開(kāi)下口夾，使溶液約以1 ml/min的速度流出。 ⑶ 洗柱：以0.2 mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1 mol/L NaCl）洗滌**洗出液的OD280＜0.02為止。
收集全部的洗脫液，測(cè)得的OD280值×洗脫液的總ml數(shù)即為未偶聯(lián)蛋白的含量，由此可計(jì)算偶聯(lián)率。
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