在過去的三十年中，分離生物大分子的各種技術(shù)和方法得到了不斷的發(fā)展。隨著各種介質(zhì)的完善和商品化，使以填料為核心的柱層析技術(shù)在天然產(chǎn)物等粗提后的純化中起到了重要作用。 

1 疏水作用柱層析(Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC) 

HIC是以蛋白質(zhì)的疏水性為分離基礎(chǔ)的。具體說就是一種通過表面疏水性差異來分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。 

疏水鍵的形成對于非極性基雙方無特異性要求，不同蛋白質(zhì)表面及內(nèi)部疏水區(qū)的多少、大小、強(qiáng)弱、分布及空間位阻效應(yīng)各不相同，這也是HIC分離蛋白質(zhì)的根本所在。在20種氨基酸中有8種是疏水性氨基酸，其強(qiáng)弱順序?yàn)門rp、Ile、Phe、Pro、ValLeu、Met、Ala。當(dāng)介質(zhì)和上樣蛋白濃度不變時(shí)，影響HIC的因素較多，主要有①鹽類，其作用是使暴露出界面的非極性基，使容易形成疏水作用，其次是增加水相極性，提高界面的表面張力，鹽濃度越高，促疏水作用越強(qiáng)。一般常采用的促疏鹽為(NH4)2SO4。②混溶有機(jī)溶劑，作用是使界面張力減弱，減少疏水作用。③溫度，當(dāng)體系溫度由4℃升高到25℃時(shí)，疏水作用力增加20%～30%，這主要是由于動(dòng)能增大，提高表面張力，一般當(dāng)溫度降低，可增大鹽濃度，使疏水作用不降低。④pH，當(dāng)pH≈pI時(shí)可消除表面電荷的相斥作用，同時(shí)表面活性劑與變性劑也對其有影響。 

HIC適用范圍廣，原則上可用于所有蛋白質(zhì)純化，處理量大，特別是從大體積樣品中提取低含量的目標(biāo)蛋白顯優(yōu)勢，可取代傳統(tǒng)的鹽析沉淀技術(shù)。HIC對DNA及小牛血清(其中的白蛋白、免疫球蛋白、氨基酸等成分)去除率較高，尤其是對細(xì)胞DNA一步去除率可達(dá)90%以上。原則上HIC可放在純化工藝的任何位置，但大部分放在前面。由于它也屬吸附型柱層析，尤其是對蛋白質(zhì)空間內(nèi)部的疏水作用可使此步損失較大，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)也有微細(xì)作用。 2凝膠過濾柱層析(Gel Filtration Chromatography，GFC) 

GFC是以分子大小和形狀為分離基礎(chǔ)的。具體說就是利用不同大小分子通過凝膠滯留時(shí)間的差別來分離混合物的柱層析方法。另外一種說法是分離是以分子體積的大小為基礎(chǔ)的，分子體積即分子溶劑化后的體積，受分子形狀和相對分子質(zhì)量兩方面因素的影響。有時(shí)加入變性劑(尿素、鹽酸胍等)以破壞蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)，可以使分離主要受控于相對分子質(zhì)量的大小。 

GFC特別適用于分離相對分子質(zhì)量大于2000的高分子化合物和相對分子質(zhì)量差異大的混合物及低聚物。GFC的分離不依賴于流動(dòng)相和固定相的相互作用，所以不必使用梯度洗脫。但是由于電荷屏蔽的因素，為了降低填料與生物分子之間的相互作用，往往會(huì)適當(dāng)提高鹽濃度，**少高于0.05 mol/LNaCl。由于試樣在柱中的保留時(shí)間不會(huì)超出柱中溶劑的總體積(Vt)，所以不會(huì)出現(xiàn)在其他液相色譜中經(jīng)常出現(xiàn)的由于色譜峰的彌散而引起的檢測極限GFC的容量通常由流動(dòng)相效應(yīng)來控制。由于GFC的分離靠大小組分流程途徑長短之差達(dá)到分離，柱要有足夠的長度(75～100 cm)，但由于微小的粒子在GFC也有擴(kuò)散的效應(yīng)，柱子又不可過長，上樣量不可過多(<20%Vt)。因?yàn)镚FC洗脫時(shí)間可粗略估計(jì)，所以再隔一定時(shí)間連續(xù)進(jìn)樣，提高柱的使用效率，縮短純化周期。除了以上特點(diǎn)外，GFC還有回收率較高，洗脫條件溫和，不易發(fā)生副反應(yīng)，使用壽命較長，同時(shí)可用作換鹽等特點(diǎn)。但由于處理量小，分離蛋白能力相對較弱，柱層析時(shí)間較長，在設(shè)計(jì)純化工藝時(shí)一般不宜放在前面。 

3離子交換柱層析(Ion Exchange Chromatography，IEC) 

IEC是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體說就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異，在離子吸附劑上靜電吸附能力不同，用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫，從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。離子交換又分為陰離子交換和陽離子交換。離子交換劑又有強(qiáng)弱之分，強(qiáng)的離子交換劑在整個(gè)pH范圍內(nèi)都是離子化的，而弱的離子交換劑通常僅在pH6～9之間是離子化狀態(tài)，因而后者對所適用的pH范圍又有了進(jìn)一步的限制。 

在洗脫方式上，陽離子交換主要是改變pH，它主要應(yīng)用于等電點(diǎn)大于5的蛋白質(zhì)；而陰離子交換主要是改變鹽濃度，適用于大部分蛋白質(zhì)。20種氨基酸中，大部分帶正電或負(fù)電，這是IEC應(yīng)用范圍廣的原因。IEC處理量大，附載系數(shù)高，一步縮小樣品體積很多。IEC去除雜質(zhì)能力強(qiáng)，如對熱原質(zhì)，核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白，及電荷性有差別的蛋白均可去除。它還有一個(gè)特點(diǎn)，利用蛋白質(zhì)在不同pH和鹽濃度下帶電性的不同，通過不同條件下應(yīng)用同種類型或不同類型介質(zhì)(如DEAE、CM)，分兩步IEC使目標(biāo)蛋白質(zhì)達(dá)到提純目的，這是除親和柱層析外，別的柱層析達(dá)不到的分離能力。IEC原則上講可放在純化工藝的任何一步，它屬吸附型層析，單步損失也較大。擴(kuò)大純化工藝時(shí)，尤其要按放大直徑考慮，而不能只單獨(dú)放大柱高。一般來說柱高不能大于柱直徑的4倍，否則純化結(jié)果和小試會(huì)相差較多。 

IEC的洗脫一般分3種：①同步洗脫(Isocratic)，即鹽濃度不變，這一般都應(yīng)用于樣品的性質(zhì)已熟知，洗脫重復(fù)性好，而且大部分是用于分析類分離。②分步洗脫(Stepwise)，即用幾次同步洗脫方式，分別換幾次鹽濃度分步洗脫。這種方式大部分用于在其中一種鹽濃度洗脫峰中收獲一種目標(biāo)蛋白，但這種方式也存在一些問題，如一個(gè)洗脫峰可含有二種蛋白或一個(gè)蛋白分散于兩個(gè)峰中，所以一般分步洗脫方式**好用于已知性質(zhì)的蛋白質(zhì)分離。③梯度洗脫(Gradient)，按一定的濃度梯度連續(xù)改變鹽濃度進(jìn)行洗脫的方式。如增加速度不變稱為線性梯度洗脫(Line Gradient)，這種方式在三種洗脫中響應(yīng)能力**強(qiáng)，蛋白峰形一般不會(huì)拖尾，很少有一種蛋白出現(xiàn)在幾個(gè)峰中。所以對電荷性質(zhì)相近組分的分離和蛋白質(zhì)較大、表面電荷分布范圍廣的組分的分離**好采用這種方式。 4親和柱層析(Affinity Chromatography，AC) #p#分頁標(biāo)題#e#

AC是以蛋白質(zhì)特殊結(jié)構(gòu)為分離基礎(chǔ)的。具體說就是利用蛋白質(zhì)和介質(zhì)特殊的生物親和性或?qū)Ｒ恍院推渌鞍踪|(zhì)分離的柱層析方法。如酶2底物或抑制物，抗原2抗體。 

AC的三個(gè)基本條件是：①偶聯(lián)凝膠，起支架作用。②配體，是AC的特征。在支持物和分離物間起聯(lián)接作用，這種和分離物特異的親和吸附具有專一性，并且是可逆的。③間臂，由于生物大分子空間位阻作用，需加一間臂，度很重要，太短不起作用，太長增加非特異性吸附，降低親和作用效率。 

     AC具有分離純化目標(biāo)單一，回收率很高的特點(diǎn)。從理論上來講，AC得到的是相當(dāng)純的物質(zhì)，這種分離能力是其他任何柱層析都難以相比的，但由于AC柱制作工藝復(fù)雜，同時(shí)在色譜洗脫過程中配體不可避免的脫落，不但柱子的使用壽命有限，而且必須經(jīng)特別處理才可注射或服用，因此成本比較昂貴，一般不放在純化工藝的前面。 

5 金屬螯合層析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography，IMAC)     IMAC是根據(jù)蛋白質(zhì)中組氨酸等氨基酸殘基和介質(zhì)中特殊金屬離子進(jìn)行金屬螯合作用，形成絡(luò)合物以分離蛋白質(zhì)的柱層析方法。蛋白質(zhì)表面暴露出一定的氨基酸殘基(His、Cys、Try)是蛋白質(zhì)吸附所需要的。蛋白質(zhì)側(cè)鏈空間排列方式起重要作用，如電荷、分子體積、氨基酸組成等分子性質(zhì)相似，但二級和三級結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)分子可以分離。層析中單純的離子吸附和其他一些復(fù)雜因素可以減少或通過高離子強(qiáng)度的緩沖液進(jìn)行改善，螯合作用受pH的影響，降低pH可解析已吸附的物質(zhì)，但也有一些例外。在IMAC中可應(yīng)用幾種洗脫方式，如pH梯度洗脫、競爭配體洗脫、有機(jī)溶劑洗脫、螯合劑洗脫。IMAC純化蛋白質(zhì)時(shí)，金屬與蛋白質(zhì)表面暴露的氨基酸殘基作用。IMAC在分離相應(yīng)的蛋白質(zhì)時(shí)，分離率和回收率也較高，它一般放在純化工藝的中后期。 

某些蛋白質(zhì)、氨基酸和一些金屬離子的特異親和力舉例如下：Cu-同含氮化合物、單核苷酸、人乳鐵蛋白；Ni-同含酪氨酸、色氨酸的蛋白質(zhì)或多肽、核酸；Zn-同含組氨酸、半胱氨酸的蛋白質(zhì)或多肽。 

通過對柱層析及純化蛋白等理論的深入學(xué)習(xí)，才可將理論知識(shí)與實(shí)踐中積累的經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合，從而，提高在天然產(chǎn)物的提取分離等方面的能力，為將來走上工作崗位奠定良好的基礎(chǔ)。