從個(gè)人學(xué)術(shù)性實(shí)驗(yàn)室到大型的醫(yī)藥制造企業(yè)，小型或者大規(guī)模的蛋白純化通常都需要幾種類型的液相色譜儀。這些相關(guān)的大部分技術(shù)已應(yīng)用了多年，但是新型柱料的發(fā)展為這些利用蛋白物理和化學(xué)特性進(jìn)行分離的，經(jīng)過(guò)時(shí)間考驗(yàn)的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是... 

關(guān)鍵詞：蛋白離子交換分離分子物質(zhì)樹(shù)脂 

  從個(gè)人學(xué)術(shù)性實(shí)驗(yàn)室到大型的醫(yī)藥制造企業(yè)，小型或者大規(guī)模的蛋白純化通常都需要幾種類型的液相色譜儀。這些相關(guān)的大部分技術(shù)已應(yīng)用了多年，但是新型柱料的發(fā)展為這些利用蛋白物理和化學(xué)特性進(jìn)行分離的，經(jīng)過(guò)時(shí)間考驗(yàn)的方法注入了新的力量。其中**值得提到的就是凝膠過(guò)濾層析技術(shù)（gel filtration，GF），離子交換層析技術(shù)（ion exchange，IEX），羥基磷灰石層析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用層析（hydrophobic interaction，HI)，以及親和層析和高效液相色譜方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。   對(duì)于一個(gè)初接觸蛋白純化的新手而言，從哪兒下手也許是令人頭疼的一件事，但是幸運(yùn)的是目前這些流程都已經(jīng)逐步系統(tǒng)化了。GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技術(shù)顧問(wèn)Andrew Mitchell解釋道，通常利用液相色譜技術(shù)進(jìn)行蛋白純化有三步：   捕獲——從細(xì)胞其它成份，比如DNA和RNA中分離需要的蛋白； 

  區(qū)分——從與目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化學(xué)特征的污染物中分離蛋白； 

  修飾——使分離得到的樣品處于可使用狀態(tài)。 

  這每一個(gè)純化的步驟都有特定的色譜層析技術(shù)和**佳的beads大小。 

  **步捕獲步驟，也就是從細(xì)胞裂解物粗成份中分離蛋白，這需要一個(gè)具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比較大，范圍比較寬（比較于bead大小平均值）的“fast flow”填料比較理想，這種填料也有利于防止目標(biāo)蛋白被水解——因?yàn)樗俣缺容^快。   第二步則對(duì)分辨率要求更高，需要更好的從混合物中分離需要的成份。通常bead的大小與分辨率成反比，因此在這一部中比較小的bead比較合適。吸附性的技術(shù)，比如離子交換IEX和疏水作用HI通常被用在純化的這前兩個(gè)步驟，而凝膠過(guò)濾則會(huì)留到了**后的修飾那一步，用于小體積，高濃度的樣品。另外要注意，進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析時(shí)，樣品的體積應(yīng)該保持在柱床體積的1%到4%。 

  選擇柱料的時(shí)候有兩個(gè)因素要考慮到，針對(duì)目的蛋白的選擇性和有效性——這些可以由洗脫峰的寬度來(lái)說(shuō)明。其中選擇性主要是指填料與目的蛋白相互作用以及結(jié)合的能力，IEX和HI層析方法就是指目標(biāo)分子與篩分介質(zhì)之間的相互作用，而GF的選擇性依賴于填料的分餾范圍（fractionation range）。 

  柱料的有效性則是指層析介質(zhì)洗脫樣品得到顯著層析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比較寬，那么即使是選擇性很好，分辨率仍然會(huì)被消弱”。bead越大，洗脫峰就越不集中，柱子的有效性就越低。純化洗脫相近的蛋白需要高效性，高選擇性和高效性的結(jié)合就會(huì)得到高分辨率。 

  凝膠過(guò)濾層析(gel filtration chromatography) 

  凝膠過(guò)濾法（gel filtration）也稱為排阻層析（exclusion chromatography）、凝膠層析（gel chromatography）或分子篩層析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后發(fā)展出來(lái)的技術(shù)。 

  凝膠是由膠體溶液凝結(jié)而成的固體物質(zhì)，內(nèi)部具有網(wǎng)狀篩孔，利用球狀凝膠內(nèi)的篩孔，使分子流過(guò)填充凝膠的管柱時(shí)，大分子無(wú)法進(jìn)入凝膠篩孔，而只流經(jīng)凝膠及管柱間的孔隙，很快就可以流出管柱，較小的分子因?yàn)檫M(jìn)入凝膠內(nèi)的篩孔，故在管柱內(nèi)的停留時(shí)間較長(zhǎng)，由此區(qū)分大小不同的分子，亦可與已知大小的分子作比較而定出一分子的分子量。一般狀況下，凝膠不會(huì)吸附成份，所有欲分離物質(zhì)都會(huì)被洗出，這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。 目前常用的凝膠包括3個(gè)主要類型：   1. Polydextran 

  Polydextran的商品名稱是Sephadex，它幾乎不溶于溶劑中，親水性強(qiáng)，能迅速在水和電解質(zhì)溶液中膨脹，在堿性的環(huán)境中十分穩(wěn)定，所以可以用堿去除凝膠上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型號(hào)，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的數(shù)字為凝膠吸水量再乘以10，以G-25為例，表示1克干燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml。 

  GE的Sephadex G-25柱就是這一系的產(chǎn)品，十分適合于快速處理不同體積的樣品，可以用在層析純化的前、中、后的任一階段，即適用于實(shí)驗(yàn)室操作，也可以在生產(chǎn)上應(yīng)用。達(dá)柱體積30％的樣品可通過(guò)簡(jiǎn)單的一次性上柱，脫鹽并轉(zhuǎn)換道新的緩沖液中，一些不需要的低分子量的物質(zhì)，如鹽分子就被洗脫了，這種產(chǎn)品**大的特點(diǎn)就是高速和高容量，處理起樣品來(lái)快速高效。   2. Polyacrylamide 

  Polyacrylamide是一種合成凝膠，商品名Bio-Gel P，干粉顆粒狀，在溶劑中自動(dòng)溶成膠體，依膠的分離范圍不同，分成Bio-Gel P-2**Bio-Gel P-300，P后面的數(shù)字乘以1000為**大過(guò)濾限度。Polyacrylamide的化學(xué)性質(zhì)不活潑，但它在極端的pH 下會(huì)被水解，水解后產(chǎn)生的COOH-具有離子交換的性質(zhì)，因此pH 值應(yīng)盡量控制在2-10之間。   3. Agarose 

  商品名Separose，屬于天然凝膠，依凝膠中干膠的百分含量，分為Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一種大孔凝膠，主要用于像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質(zhì)，因其顆粒軟，在分離過(guò)程有時(shí)會(huì)阻塞管柱，造成流速減慢，又因其在攝氏50度以上會(huì)融化，故需于較低溫的環(huán)境中進(jìn)行層析。Agarose 做成beads后不能再脫水干燥，所以要在濕態(tài)中保存。凝膠和管柱的選擇： #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

  凝膠的材質(zhì)需為化學(xué)惰性，與分離物不能產(chǎn)生變性（denature）或是其它化學(xué)反應(yīng)，**好具有能長(zhǎng)期反復(fù)使用的穩(wěn)定性，并可以在較大的pH和溫度范圍內(nèi)使用。由于凝膠上的離子交換基團(tuán)會(huì)吸附帶電荷的物質(zhì)，產(chǎn)生離子交換的效果，所以凝膠上**好不具有離子交換的基團(tuán)。此外，凝膠要有一定的機(jī)械強(qiáng)度，在層析過(guò)程中才不會(huì)變形，增加機(jī)械強(qiáng)度也可使層析在較高壓力的環(huán)境進(jìn)行，縮短分離時(shí)間。 

  凝膠顆粒的粗細(xì)與分離效果有直接關(guān)系，顆粒細(xì)的分離效果好，但流速慢而費(fèi)時(shí)，因此要依據(jù)實(shí)際的需要來(lái)選擇。對(duì)于分子量較小的物質(zhì)，一般采用polydextran或polyacrylamide材質(zhì)的凝膠，大分子物質(zhì)則使用agarose。 

  以Sephadex為例，Sephadex G-50可用于區(qū)分分子量1,500~30,000之分子，而Sephadex G-75 凝膠可區(qū)分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分離分子量10,000及20,000之分子，兩種都適用。 

  如果要分離的分子大小相差很多，則可選用柱高：直徑＝5：1~15：1的管柱，且管柱體積要大于4~15倍的樣品體積；如果要分離的物質(zhì)之間分子量差異不大，則要選用柱高：直徑＝20：1~100：1的管柱，且管柱體積要大于25~100倍的樣品體積。   凝膠的處理： 

  商品凝膠一般是干燥的顆粒，使用前要先泡在欲使用的沖洗液中，使它充份膨脹，否則有引起凝膠柱破裂的危險(xiǎn)。熱脹法是常用的前處理法，即把浸于沖洗液中的凝膠加熱，讓它膨脹并除去氣泡，溫度夠高的話（加溫**近沸騰）也可消毒殺菌。凝膠處理過(guò)程不能劇烈攪拌，如此易使顆粒破裂，影響流速。 

  將凝膠裝入管柱的方法有很多種，實(shí)驗(yàn)室常用的方法是先在柱中加入約1/3 體積的沖洗液，邊輕輕攪伴邊將凝膠懸浮液倒入其中，等到底部沉積約1~2公分的凝膠后，打開(kāi)下方出口讓水流出，上面不斷加入懸浮液，等到沉積到離頂部約3~5公分處停止，讓3~5倍柱床體積的緩沖液流過(guò)層析柱。若用polydextran的凝膠，可放入有顏色的蛋白質(zhì)（如cytochrome c）流過(guò)管柱，看看色帶是否均勻下降，不均勻或出現(xiàn)氣泡，凝膠均需倒出重新填裝。   沖洗緩沖液僅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再將出口打開(kāi)使沖洗液流到距表面1~2公厘，關(guān)閉出口，用滴管緩緩加入樣品再打開(kāi)出口，樣品完全滲入凝膠內(nèi)后，加入約4公分沖洗液，出口處接上收集瓶開(kāi)始層析。 

  由于polydextran 和agarose都屬于多醣類，一旦微生物生長(zhǎng)過(guò)多，分泌的酶會(huì)水解凝膠使其性質(zhì)改變，為了防止這種情況發(fā)生，凝膠**好采用真空或低溫保存，但溫度不能過(guò)低使凝膠凍結(jié)。加入抑菌劑（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。長(zhǎng)時(shí)間不用的凝膠可用干燥保存法，也就是把使用過(guò)的凝膠用水除去碎顆粒和雜質(zhì)，再用不同濃度的酒精，由70%、90%到95%逐步脫水，在攝氏60~80度下烘干，不能加熱的Sepharose則用乙醚洗滌干燥。   離子交換層析（ion exchange，IEX） 

  離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動(dòng)相的系統(tǒng)中進(jìn)行的。離子交換劑是由基質(zhì)、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應(yīng)主要以離子交換方式進(jìn)行，或借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對(duì)溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。 

  離子交換層析法大致分為5個(gè)步驟：   1. 離子擴(kuò)散到樹(shù)脂表面。   2. 離子通過(guò)樹(shù)脂擴(kuò)散到交換位置。 

  3. 在交換位置進(jìn)行離子交換；被交換的分子所帶電荷愈多，它與樹(shù)脂的結(jié)合愈緊密，也就愈不容易被其它離子取代。   4. 被交換的離子擴(kuò)散到樹(shù)脂表面。  5. 沖洗液通過(guò)，被交換的離子擴(kuò)散到外部溶液中。 

  離子交換樹(shù)脂的交換反應(yīng)是可逆的，遵循化學(xué)平衡的規(guī)律，定量的混合物通過(guò)管柱時(shí)，離子不斷被交換，濃度逐漸降低，幾乎全部都能被吸附在樹(shù)脂上；在沖洗的過(guò)程中，由于連續(xù)添加新的交換溶液，所以會(huì)朝正反應(yīng)方向移動(dòng)，因而可以把樹(shù)脂上的離子沖洗下來(lái)。   如果被純化的物質(zhì)是氨基酸類的分子，則分子上的凈電荷取決于氨基酸的等電點(diǎn)和溶液的pH值，所以當(dāng)溶液的pH 值較低，氨基酸分子帶正電荷，它將結(jié)合到強(qiáng)酸性的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂上；隨著通過(guò)的緩沖液pH逐漸增加，氨基酸將逐漸失去正電荷，結(jié)合力減弱，**后被洗下來(lái)。由于不同的氨基酸等電點(diǎn)不同，這些氨基酸將依次被洗出，**先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid（在約pH3~4時(shí)），隨后是中性氨基酸，如glycine和alanine。堿性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的緩沖液中仍帶有正電荷，因此這些在約pH值高達(dá)10~11時(shí)才出現(xiàn)。   樹(shù)脂材質(zhì)： 

  **常見(jiàn)的離子交換樹(shù)脂材質(zhì)是聚苯乙烯-苯二乙烯（polystyrenedivinylbenzene），它是由苯乙烯（styrene）和苯二乙烯（divinylbenzene）聚合產(chǎn)生的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，舉例來(lái)說(shuō)，Dow化學(xué)公司所生產(chǎn)的樹(shù)脂Dowex 50×8，表示含8%苯二乙烯。   根據(jù)交換樹(shù)脂的性能，分為陽(yáng)離子與陰離子交換樹(shù)脂。   1. 陽(yáng)離子交換樹(shù)脂 

  分為強(qiáng)酸型、中強(qiáng)酸型和弱酸型三類，強(qiáng)酸型樹(shù)脂含有－R－SO3H，中強(qiáng)酸型樹(shù)脂含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型樹(shù)脂含有－COOH或－OH。   2. 陰離子交換樹(shù)脂 

  分為強(qiáng)堿型、中強(qiáng)堿型和弱堿型三類，含有銨鹽，四級(jí)銨鹽 [ －N+(CH3)3] 為強(qiáng)堿型樹(shù)脂，三級(jí)以下銨鹽 [－N(CH3)2]、[ －NHCH3]、[ －NH2] 都屬弱堿型樹(shù)脂；同時(shí)具有強(qiáng)堿和弱堿型基團(tuán)的，為中強(qiáng)堿型的樹(shù)脂。 

  除了樹(shù)脂以外，纖維素（cellulose）、葡聚糖凝膠（Sephadex gel）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）也是常用的離子交換材質(zhì)，特性是具有親水性和較大的表面積，對(duì)生物活性物質(zhì)而言，是一個(gè)較為溫和的環(huán)境，同時(shí)也是大分子所適用的分離純化材質(zhì) 。 

  實(shí)驗(yàn)證明，纖維材質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的分離純化效果相當(dāng)好，因?yàn)殡x子交換纖維的種類多，能依據(jù)不同分離目的使用，且功能團(tuán)基主要在表面，對(duì)生物大分子的交換十分有利。   離子交換劑的選擇： 

  離子交換劑的選擇，shou重保持欲分離物質(zhì)的生物活性，以及在不同pH值環(huán)境中，此物質(zhì)所帶的電荷和電性強(qiáng)弱。   1. 陰陽(yáng)離子交換劑的選擇 

  若被分離物質(zhì)帶正電荷，例如polymyxin、 cytochrome C這些堿性蛋白質(zhì)，它們?cè)谒嵝匀芤褐休^穩(wěn)定，親和力強(qiáng)，故采用陽(yáng)離子交換劑；其它像heparin、nucleic acid這類酸性物質(zhì)，在堿性溶液中較穩(wěn)定，則使用陰離子交換劑；如果欲分離的物質(zhì)是兩性離子，一般考慮在它穩(wěn)定的pH范圍帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。以胰島素（iulin）為例，它的等電點(diǎn)為pH 5.3，因此在pH<5.3（酸性）溶液中，采用陽(yáng)離子交換劑，在pH>5.3的堿性溶液中，使用陰離子交換劑。 

  簡(jiǎn)而言之，已知等電點(diǎn)的物質(zhì)，在高于等電點(diǎn)的pH條件下，因帶有負(fù)電荷，應(yīng)采用陰離子交換，在低于等電點(diǎn)的pH下，則采用陽(yáng)離子交換。未知等電點(diǎn)的物質(zhì)，在一定pH條件下進(jìn)行電泳，向陽(yáng)極移動(dòng)較快的物質(zhì)，在同樣條件下可被陰離子交換劑吸附，向陰極移動(dòng)較快的物質(zhì)可被陽(yáng)離子交換劑吸附。   2. 緩沖液的選擇 

  緩沖液酸堿度的選擇，決定于被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)、穩(wěn)定性、溶解度和交換劑離子的pK值。使用陰離子交換纖維時(shí)要選用低于pK值的緩沖液，若欲分離的物質(zhì)屬于酸性，則緩沖液的pH值要高于該物的等電點(diǎn)；用陽(yáng)離子交換纖維時(shí)要選用高于 pK值的緩沖液，目的物屬于堿性物質(zhì)的話，緩沖液要低于該物等電點(diǎn)的pH值。 

  緩沖液離子以不干擾分離物活性測(cè)定、不影響待測(cè)物溶解度、不發(fā)生沉淀為原則，如使用UV吸收法測(cè)樣品，那么pyridine或barbital這類會(huì)吸收UV的物質(zhì)就不適用。   離子交換樹(shù)脂的前處理： 

  離子交換樹(shù)脂使用前，先以蒸餾水除去其內(nèi)之雜質(zhì) ，并以NaOH和HCl處理樹(shù)脂，使其上的官能基完全露出。陰離子交換樹(shù)脂先以15倍于樹(shù)脂量的0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘，再以水清洗**pH 7.0，之后用0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘，同樣以水清洗**pH 7.0，**后用欲使用的緩沖液浸泡。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂用15倍于樹(shù)脂量的0.5 N NaOH浸泡30~120分鐘，以水清洗**pH 7.0，之后用0.5 N HCl 浸泡30~120分鐘，再以水清洗**pH 7.0，**后用欲使用的緩沖液浸泡。   親和層析（affinity chromatograph) 

  親和層析也稱為功能層析（function chromatography）、生物專一吸附（bioecific adsorption）或是選擇層析（selective chromatography）。所謂的親和力，即生物大分子和其配體（ligand）之間形成可逆結(jié)合的能力，如酵素和它的底物（sutrate）、抗體和抗原、激素和受體（receptor）、RNA和其互補(bǔ)的DNA等，親和層析就是根據(jù)這種親和力發(fā)展出來(lái)的純化方法，例如將酶的sutrate接在固體支持物上，再用此支持物填裝管柱，當(dāng)含有這種酶的樣品溶液通過(guò)管柱時(shí)，酶便被吸附在管柱上，其它的蛋白質(zhì)及雜質(zhì)不被吸附，全部從層析柱流出，**后使用適當(dāng)?shù)木彌_液，將欲分離的酶從柱中洗出來(lái)，經(jīng)過(guò)這些步驟便能得到純化的酶。   材質(zhì)選擇： 

  要進(jìn)行親和層析，ligand的選擇相當(dāng)重要，ligand可以是輔酶、酶的抑制劑或抗體，具備的條件如下： 

  1. 能與要分離的物質(zhì)進(jìn)行專一性的結(jié)合，親和力愈大愈好。 

  2. Ligand與分子結(jié)合后，在一定的條件下又能解離，而且不會(huì)因解離破壞原本的生物活性。 

  3. Ligand上具有能連結(jié)到固體支持物上的團(tuán)基，結(jié)合后不影響它與欲分離物質(zhì)的結(jié)合專一性。 

  在實(shí)際操作上，若要純化的是某一種酶，則lignad選用此酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑、底物、輔酶或是效應(yīng)劑（effector ）；若是要純化酶的抑制劑，就選用此酶作為ligand；純化能與某維生素結(jié)合的蛋白質(zhì)，可以使用這種維生素當(dāng)ligand；純化激素的受體（receptor），選用激素當(dāng)ligand。純化核酸可利用核酸與蛋白質(zhì)的交互作用、DNA之間的互補(bǔ)關(guān)系、DNA與RNA的hybridization，運(yùn)用適當(dāng)?shù)膌igand。 

  親和層析中與ligand連接的支持物多為凝膠，凝膠應(yīng)具備以下條件：   1. 不溶于水，但具有親水性，如此ligand才容易接近水溶液中的欲分離物。   2. 化學(xué)惰性，沒(méi)有（或極少）離子交換這一類非專一性的結(jié)合。   3. 具有足夠的化學(xué)團(tuán)基，經(jīng)活化后能與大量的ligand結(jié)合。   4. **好是均一的球狀顆粒，制成的管柱才能有較佳的流速。   5. 具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，方便大分子自由通過(guò)。 

  6. 物理及化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不因洗出時(shí)改變的各種pH值、離子濃度、溫度或界面活性劑而改變其結(jié)構(gòu)。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#

  親和層析法使用的支持物種類，部份與膠體過(guò)濾法重復(fù)，除了Polydextran、Polyacrylamide、Agarose以外，Ultrogel是能承受較大壓力的凝膠，流速高；cellulose 主要用于親和免疫層析，但它有非專一性吸附的性質(zhì)；Bio-gla是硼硅酸鈉經(jīng)高溫和酸堿處理制成的多孔玻璃，質(zhì)地硬、強(qiáng)度高、孔徑均勻、不怕微生物侵襲，但缺點(diǎn)和cellulose一樣，它的表面對(duì)蛋白質(zhì)也有非專一性吸附。   樣品的分離： 

  要使要分離的物質(zhì)與ligand分離，通常采用改變pH、離子濃度或緩沖液的組成，使其親和力降低，有時(shí)使用0.1M醋酸或0.1M 氫氧化鈉沖洗，就能得到不錯(cuò)的效果。如果純化對(duì)象與ligand的親和力不強(qiáng)，當(dāng)連續(xù)通過(guò)大量的平衡緩沖液，就能在雜質(zhì)洗出后，得到所要的物質(zhì)；若親和力較強(qiáng)，則要使用較強(qiáng)的酸或堿作為沖洗液，或是添加guanidine hydrochloride，但這些溶液容易使純化對(duì)象失去生物活性；用較高濃度的ligand溶液亦可將管柱上所吸附的物質(zhì)洗出，此ligand可以與管柱上的相同或相異。 

  對(duì)于親和力小的物質(zhì)，上柱的樣品**好是體積小而濃度高，粘度較大的溶液，可以將一定量的ligand加到待分離的溶液中，攪拌平衡一段時(shí)間，進(jìn)行過(guò)濾或離心，**后進(jìn)行洗出的步驟。由于生物大分子和其ligand間達(dá)到反應(yīng)平衡的速度很慢，樣品上柱的流速要盡量慢；通常親和力會(huì)隨溫度增高而降低，其中一例是將乳酸脫氫酶從管柱上的AMP洗下來(lái)時(shí)，所需的NADH濃度隨溫度增高而減少，在攝氏零度到十度間的變化尤其明顯，因此如果待分離的物質(zhì)在攝氏4度可被緊密吸附，在攝氏25度以上容易被洗下來(lái)，則可在4度環(huán)境下進(jìn)行親和吸附，在25度以上的環(huán)境進(jìn)行洗出的步驟。 

  說(shuō)到經(jīng)典的親和層析柱，當(dāng)然要提到GE公司的**產(chǎn)品Ni Sepharose High Performance填料，Ni Sepharose分有許多不同的凝膠類型，主要是根據(jù)凝膠顆粒的大小來(lái)區(qū)分，這些鎳瓊脂糖凝膠產(chǎn)品受到廣大科研工作者的歡迎，但基本上都是以層析系統(tǒng)或者散包裝出售的。所以要提一下一款His inTrap，His inTrap只需使用一臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)的小型離心機(jī)就可以完成純化步驟。過(guò)程也就是將均一、澄清的細(xì)胞裂解物加入到柱子中就可以直接進(jìn)行純化，樣品無(wú)需離心或過(guò)濾處理。所以說(shuō)His inTrap省去了煩雜的樣品制備時(shí)間，節(jié)省了研究人員的勞動(dòng)力，每10分鐘就可以進(jìn)行一次小型純化。因?yàn)榧兓臅r(shí)間變短，使樣品降解或者氧化的可能性也變小，也就**大程度保持了樣品蛋白的活性。 

  這個(gè)柱子的蛋白結(jié)合率達(dá)到750ug，并且與系列的添加、變性和還原試劑兼容。由于它是專門為了小體積蛋白純化而設(shè)計(jì)，這系列產(chǎn)品特別適合用于摸索細(xì)菌裂解物**佳蛋白純化條件。 

  在產(chǎn)品方面，GE還有一系列高分辨液相色譜柱：Tricorn，主要用于分析和純化包括蛋白質(zhì)、肽、核酸、質(zhì)粒、生物堿、抗生素、病毒、中藥活性成份等生物分子而設(shè)計(jì)的預(yù)裝柱。Tricorn 已取代HR 預(yù)裝柱，理論塔板數(shù)達(dá)35000，分辨率比平均塔板數(shù)為8000的HPLC柱高四倍，可直接連到HPLC/FPLC/AKTA 系統(tǒng)。 

  Tricorn 預(yù)裝柱可應(yīng)用于層析聚焦、離子交換、疏水層析、分子篩等四種分離技術(shù)中。其中離子交換方面，Tricorn 提供了MiniBeads(3mm) ，MonoBeads(10mm) 和SOURCE (15mm)三種填料適合從分析到小量制備的需要；而在分子篩方面，Tricorn 提供了Superdex(窄譜) 和Superose(廣譜) 預(yù)裝柱。 

  比如說(shuō)Superdex 200 5/150凝膠柱就是一個(gè)Tricon的預(yù)裝柱,床層高度為150毫米。當(dāng)純化的時(shí)間、樣品和緩沖液的消耗顯得比獲得盡可能高的分辨率更為重要時(shí)，這種柱子是一個(gè)很好的選擇。Superdex 200 5/150凝膠柱可被廣泛應(yīng)用，例如膜純化過(guò)程中條件的篩選、蛋白質(zhì)之間相互作用的研究、快速分析單克隆抗體的純度和重組蛋白質(zhì)純化過(guò)程中需要采用少量緩沖液而不需要采用更長(zhǎng)的柱子時(shí)。柱子的高效率保證了純化過(guò)程極好的重復(fù)性，并可以在各種不同的純化系統(tǒng)上操作使用。 

  除了GE以外，默克在色譜*域也是世界上**的大公司之一，這個(gè)世界上**大的色譜級(jí)硅膠和在GMP條件下生產(chǎn)噸級(jí)二氧化硅的制造商得到了許多顧客和代理商的認(rèn)可，其產(chǎn)品線覆蓋高效液相分析色譜HPLC*域，制備色譜*域，薄層層析色譜*域和樣品前處理。 

  它旗下的主要色譜柱包括Lichroher色譜柱、Puroher STAR 明星家族色譜柱以及整體化色譜柱Chromolith，其中puroherstar明星家族色譜柱采用合成硅膠為原料，填料的純度高，將造成分析困難的金屬含量降低**10m以下，而且，將硅膠表面的鍵合工藝進(jìn)行改進(jìn)，使得反相填料的酸堿耐受性提高**1.5~10.5。puroheròstar家族是采用**先進(jìn)的原料和技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)的色譜柱。它們?nèi)诤狭酥噩F(xiàn)性好、壓力穩(wěn)定性好的典型特征以及在分離效率、柱效高和ph穩(wěn)定范圍寬的明顯優(yōu)勢(shì)。 

  而Chromolith整體化HPLC色譜柱更是開(kāi)辟了色譜行業(yè)的新紀(jì)元，這種柱子是目前世界上**快的色譜柱。其原理是基于一種全新的液溶膠技術(shù)，采用整體化的技術(shù)制得。它采用完全不含重金屬離子的四烷氧基硅為原料，采用**技術(shù)制備得到。chromolith柱中整體化硅膠棒的多孔體系是由完全創(chuàng)新的兩種孔結(jié)構(gòu)組成：大孔結(jié)構(gòu)和中孔結(jié)構(gòu)。其中大孔的孔徑是2mm，相互交聯(lián)形成了密密麻麻的多孔網(wǎng)絡(luò)，保證流動(dòng)相可以快速通過(guò)，卻不會(huì)造成大的反壓；填料骨架上的中孔保證了填料的比表面積，比顆粒型色譜柱的比表面積高15%(傳統(tǒng)顆粒型色譜柱的比表面積為65~70%)，這保證了它的柱效。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#