GST親和層析介質(zhì)（GST Agarose）是專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及與谷胱甘肽有親和作用蛋白的分離介質(zhì)，一步分離就可得到高純度的GST融合目標(biāo)蛋白，純化條件溫和，可以保證蛋白的活性。
本產(chǎn)品是**設(shè)計(jì)合成的GST瓊脂糖凝膠，具有優(yōu)良的物理和化學(xué)穩(wěn)定性，使用壽命長(zhǎng)，操作方便，批次重復(fù)性好，易于放大，是研發(fā)與生產(chǎn)的理想選擇。 二、 性能參數(shù)
三、 適用范圍
分離谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及與谷胱甘肽有親和作用的蛋白。 四、 操作說(shuō)明 1. 緩沖液配制
緩沖液A（平衡緩沖液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，調(diào)節(jié)pH值**8.0。 緩沖液B（洗脫緩沖液）：10mM Glutathione（還原型），50mM Tris-HCl，調(diào)節(jié)pH值**8.0。因Glutathione易氧 化，需現(xiàn)用現(xiàn)配。
（注：各種溶液配制完畢后，**好進(jìn)行脫氣處理，0.45 μm濾膜過(guò)濾備用)。 2. 樣品預(yù)處理：按每克濕重菌體/2~5ml平衡緩沖液的比例充分懸浮離心收集的菌體；600w功率，每循環(huán)超聲3s，冷卻3s，循環(huán)99×3次,破碎菌體；4℃、15000rpm離心15m，收集上清液，或用0.45μm濾膜過(guò)濾。 3. 裝柱： 聚苯乙烯層析柱
1) 將層析柱固定在鐵架臺(tái)或?qū)游黾苌希忾]層析柱下端出口，向柱內(nèi)充入純水，排開(kāi)層析柱內(nèi)空氣，先將墊片完全浸沒(méi)于水面下方，在保持水平的狀態(tài)下，小心推向底部，避免墊片下方滯留氣泡。
2) 打開(kāi)層析柱下端出口，排出柱中純水；在液面低**距墊片1~1.5cm高度時(shí)封閉下端出口，用移液槍按需要量吸取介質(zhì)，或用玻璃棒緊靠柱子內(nèi)壁引流，將介質(zhì)加入到層析柱中；靜置30min，讓介質(zhì)自然沉降。
3) 從上端管口將另一墊片緩慢推**介質(zhì)沉降平面，使介質(zhì)表面保持水平狀態(tài)，注意避免墊片與介質(zhì)接觸面滯留氣泡（如對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果要求不嚴(yán)，也可不放入上墊片，以提高流速）。
4) 在使用一段時(shí)間后，如果層析柱流速減慢，可先用小鑷子沿邊緣將墊片推翻，夾出墊片，倒出介質(zhì)，清洗或更換新的墊片后，按2）、3）所述 玻璃層析柱
1) 將層析柱洗凈后垂直固定到鐵架臺(tái)上；向柱中加入蒸餾水，排開(kāi)柱子中的空氣，在蒸餾水排盡以前，關(guān)閉柱子出口，在柱內(nèi)保留5~8cm高度的蒸餾水。
2) 先將介質(zhì)混勻，用移液槍按需要量吸取介質(zhì)，或用玻璃棒緊靠柱子內(nèi)壁引流，將介質(zhì)加入到層析柱中；靜置30min，讓介質(zhì)自然沉降。
3) 從上端管口將轉(zhuǎn)換桿出液端緩慢推**介質(zhì)沉降平面，使介質(zhì)表面保持水平狀態(tài)，注意避免轉(zhuǎn)換桿與介質(zhì)接觸面間滯留氣泡。
4) 在使用一段時(shí)間后，如果流速減慢，可先卸下上轉(zhuǎn)換桿，將介質(zhì)倒出，再取出下轉(zhuǎn)換接頭中濾網(wǎng)，清洗或更換后重新裝柱。 4. 過(guò)柱：
1) 用10倍介質(zhì)體積緩沖液A過(guò)柱，平衡介質(zhì)；
2) 上樣；
3) 用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液A過(guò)柱，洗去層析柱中剩余上樣液并重新平衡介質(zhì)； 4) 用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液B洗脫，收集洗脫液； 5) 用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液A重新平衡介質(zhì)。
注：純化過(guò)程流速不宜過(guò)快，對(duì)于1ml介質(zhì)，流速保持在0.5ml/min為宜。 5. 介質(zhì)清洗
如果在使用一段時(shí)間后，介質(zhì)因表面沉積過(guò)多雜質(zhì)導(dǎo)致蛋白結(jié)合能力下降，需對(duì)介質(zhì)進(jìn)行清洗。步驟如下： 1) 沉淀或變性物質(zhì)的清洗：
用2倍介質(zhì)體積6 M鹽酸胍清洗，然后用5倍介質(zhì)體積緩沖液A平衡介質(zhì)。 2) 疏水締合物質(zhì)的清洗：
用3~4倍介質(zhì)體積70%乙醇 (或2倍介質(zhì)體積去垢劑，如 1% Triton™ X-100) 清洗介質(zhì)；然后用5倍介質(zhì)體積緩沖液A平衡介質(zhì)。 6. 介質(zhì)再生
每次層析前，為達(dá)到**佳純化效果，需對(duì)介質(zhì)進(jìn)行再生，步驟如下：
1) 2倍介質(zhì)體積高pH緩沖液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH緩沖液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脫三次。
2) 10倍介質(zhì)體積緩沖液A平衡介質(zhì)。 7. SDS-PAGE檢測(cè)：
1) 不同濃度SDS-PAGE分離膠分離范圍
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A. 每個(gè)膠孔**適蛋白上樣量為5~10μg。
B. 將含5~10μg蛋白的樣品溶液與loading buffer混勻，90℃孵育5min，取出后5000rpm離心1 min。 C. 上樣，15mA、30mA恒流或80V、120V恒壓電泳。 8.介質(zhì)保存
4℃~8℃條件下，介質(zhì)可長(zhǎng)期保存于20%乙醇中。 五、 GST Agarose分離GST融合蛋白實(shí)例
層析介質(zhì)：GST 1ml；對(duì)照GST介質(zhì)（*際**品牌）1ml
樣品：表達(dá)可溶性GST-tag融合thioredoxin的大腸桿菌BL21裂解液 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
結(jié)合緩沖液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0 洗脫緩沖液：10 mM Glutathione（還原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0 流速：GST 1ml，0.5ml/min；對(duì)照GST介質(zhì)1ml，0.5ml/min 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖1，色譜各組分的SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)圖2。 圖1 GST Agarose分離GST融合蛋白色譜圖
1.低分子量Marker；2.上樣液； 3.GST-流穿液；4.GST-洗脫液； 5.對(duì)照-流穿液；6.對(duì)照-洗脫液
1 2 3 4 5 6 圖2 純化后SDS-PAGE圖
六、GST親和層析介質(zhì)使用注意事項(xiàng)
1. GST融合蛋白與還原型谷胱甘肽的結(jié)合比較緩慢，為獲得**大結(jié)合量，需要保證足夠的作用時(shí)間，因而在上樣時(shí)要維持較低流速。在樣品中加入5~10mM DTT可以增加介質(zhì)對(duì)目標(biāo)蛋白的吸附。對(duì)于按常規(guī)步驟操作吸附效果不好的樣品，可以先把介質(zhì)和樣品混合，輕輕振搖2~4h，再裝柱，用平衡緩沖液進(jìn)行重新平衡、洗脫等操作。
2. 不同的GST融合蛋白取得**佳純化效果所需還原型谷胱甘肽濃度、洗脫體積和洗脫時(shí)間可能有所不同。必要時(shí)需對(duì)流穿液、洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE以及Western雜交分析，以確定**佳純化條件。
3.GST融合蛋白以包涵體形式存在時(shí)不能與介質(zhì)結(jié)合，必須先進(jìn)行變性、復(fù)性、透析處理后才能用介質(zhì)進(jìn)行純化。純化效果取決于復(fù)性效率。 4.純化后出現(xiàn)雜帶的常見(jiàn)原因 1) 目標(biāo)蛋白斷裂或酶解
解決方案：向緩沖液A和緩沖液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等穩(wěn)定劑。
2) GST融合蛋白不完全表達(dá)
GST融合蛋白有時(shí)候只表達(dá)到GST部分就終止，GST標(biāo)簽蛋白連同完全表達(dá)的融合蛋白均能與介質(zhì)結(jié)合并被洗脫下來(lái)，因而洗脫液中出現(xiàn)26KD左右的雜帶。
解決方案：嘗試用不同濃度的還原型谷胱甘肽洗脫；優(yōu)化表達(dá)條件，降低GST融合蛋白不完全表達(dá)量；改變外源基因在載體中插入的酶切位點(diǎn)，重新構(gòu)建表達(dá)載體；在不改變外源基因兩端酶切位點(diǎn)的情況下，更換通用載體。 5. 如后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要除去洗脫液中還原型谷胱甘肽，可采用超濾或透析的方法。 七、GST標(biāo)簽切除
GST標(biāo)簽可用位點(diǎn)專(zhuān)一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子從融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST親和層析方法去除GST標(biāo)簽，目標(biāo)蛋白存在于流出液中。一般情況下，與切除GST標(biāo)簽后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量極小，如果后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求不嚴(yán)格，不需進(jìn)一步除去與外源蛋白共存與洗脫液中的凝血酶。如需除去凝血酶，則可將樣品用pH7~8的緩沖液溶解，然后直接過(guò)1ml的苯甲脒瓊脂糖凝膠或者肝素瓊脂糖凝膠吸附凝血酶。
