一、目的
（1）掌握從雞蛋清中提取卵類黏蛋白的方法。
（2）了解凝膠層析法的工作原理，掌握其基本操作技術。
二、原理
雞卵類黏蛋白是一種糖蛋白，存在于雞蛋清中。它在中性或偏酸性溶液中對熱及高濃度的脲、有機溶劑都有較高的耐受性，但在堿溶液中不穩(wěn)定。在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍然有較好的溶解度。通常選擇合適的pH值及適當濃度的丙酮或三氯乙酸，可以從雞蛋清中除去非卵類黏蛋白，從而達到純化雞卵類黏蛋白的目的。
凝膠過濾又叫分子篩層析。分子篩指的是多孔介質，這種介質具有立體網(wǎng)狀結構，內部充滿孔隙，孔徑雖大小不一，但有一定范圍。當含有不同相對分子溶質的混合物流經(jīng)這一介質時，小分子物質能進入介質內部空隙，而大分子物質被排阻在介質之外。這樣，不同相對分子質量的溶質分子質量的溶質分子在凝膠層析過程中的移動速度不同，從而得到層析分離。
可作為凝膠過濾的介質很多，如交聯(lián)葡聚糖（商品名Sephadex）、交聯(lián)瓊脂糖（商品名Sephearose）、聚丙烯酰胺凝膠等。
將經(jīng)過充分溶脹處理的凝膠裝柱，再將含有不同相對分子質量溶質的樣品液上柱，并用同一溶劑洗脫展開，就可實現(xiàn)各溶質分離。凝膠對溶質的排阻程度可用分配系數(shù)Kav表示：
（9）布氏漏斗 （10）抽濾瓶 （11）濾紙
（12）冷凍離心機
（13）層析柱（3.5㎝×30㎝） （14）紫外分光光度計 （15）分部收集器 （16）真空泵 （17）真空干燥器
四、材料與試劑
（1）新鮮雞蛋
（2）葡聚糖凝膠sephadex G-25（50～100目） （3）丙酮。
（4）0.5mol/L三氯乙酸（TCA）
（5）0.02mol/L磷酸緩沖液(pH6.5)取磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀分別把它們配制成0.02mol/L的溶液，再按一定量的比例制成pH6.5
五、操作方法
1．卵類黏蛋白的抽提
（1）取雞蛋一只，在其底部輕磕一小洞，使蛋清沿小洞慢慢流下，將蛋清液收集到一燒杯中（注意不要使蛋黃混入）。取雞蛋清50mL，在30℃水浴中，緩慢加入等體積的0.5mol/L三氯乙酸-丙酮溶液（三氯乙酸：丙酮＝1:2），邊加邊攪拌，約30min加完，**后溶液的pH＝3.5，繼續(xù)攪拌30min，置于冰箱中靜置4h以上。
（2）2 500r/min，4℃離心20min，棄去沉淀，清液再用濾紙過濾，以除去其中的脂類物質及其他不溶性物質。收集濾液并放入500mL燒杯中。
（3）檢查濾液的pH值是否為3.5，若相差大，則應調回到pH3.5，置冰箱或冰浴下冷卻片刻。
（4）在冰浴下緩慢加入3倍體積的冷丙酮，用玻璃棒輕輕攪勻，用塑料薄膜蓋好，以減少丙酮的揮發(fā)。在冰浴中放置2h。
（5）傾出部分上清液，其余全部轉移**離心管中，3 000 r/min，4℃離心15 min，傾出上清液，將離心管底部的沉淀物放在真空干燥器內，抽氣，除去殘留丙酮，然后用5 mL蒸餾水溶解。若溶解液混濁，可用濾紙去不溶物，將溶解液用Sephed-ex G-25層析柱脫鹽或者透析除鹽。
2．凝膠層析對卵類黏蛋白提取液的純化 （1）凝膠的預處理
為使樣品通過凝膠時流速穩(wěn)定并得到很好的分離效果，應該對凝膠進行預處理。稱取30 g Sephadex G-25凝膠，用0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.5）500mL熱溶脹2h或室溫溶脹24h。在凝膠溶脹時避免劇烈攪拌，以防凝膠交聯(lián)結構的破壞。上柱前將處理好的凝膠于真空干燥器中抽氣20～30min。（2）裝柱
裝柱是凝膠層析中**重要的環(huán)節(jié)，操作時凝膠必須裝得十分均勻，中間不要有氣泡。shou先必須將柱子垂直地安裝好。取0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.5）40mL倒進柱內，待流出20～30mL后關閉柱子下端的螺旋夾。然后將脫氣后的凝膠用玻璃棒沿壁小心地緩緩倒進柱內，盡量一次裝完，以免出現(xiàn)不均勻的凝膠斷層。待凝膠沉降4～5min后打開螺旋夾，待凝膠沉降**床高20㎝處，用吸管吸出過剩的凝膠。用50～100mL磷酸緩沖液(pH6.5)沖洗凝膠柱，使柱床穩(wěn)定，然后在凝膠表面放一片干凈的濾紙，以防加樣時凝膠被沖起。特別要注意在任何時候都不要使液面低于凝膠表面，否則凝膠變干，并有可能產(chǎn)生氣泡，從而影響液體在柱內的流動。上樣前要用上述緩沖液平衡凝膠柱，待流出液在紫外分光光度計測出的280 nm吸光值小于0.02時，可停止平衡，開始上樣。
（3）上樣
為了獲得較好的分離效果，上樣量要小，**多不能超過床體積的25％～40％。加樣前，關閉柱下端的螺旋夾，用移液管慢慢地吸走凝膠上層的緩沖液，待床面只留下薄薄一層液體時開始加樣。用移液管吸取5mL雞卵類黏蛋白的粗提液小心地加到凝膠床上。并取走蓋在凝膠上的濾紙。打開柱下的螺旋夾，待樣品完全進入凝膠后，加少量磷酸緩沖液潤洗凝膠表面，待液體完全流進床內后，關閉螺旋夾，開始洗脫收集。
（4）洗脫
在貯液瓶中加入0.02mol/L磷酸緩沖液（pH6.5），控制滴加速度，保證凝膠上方液面高度為10㎝。用下口螺旋夾調節(jié)流速為0.2～0.5mL/min，打開分部收集器每10min收集一管（3mL／管），用紫外分光光度計測定各管收集液的OD280值，以管號為橫坐標，OD值為縱坐標繪出洗脫曲線，并收集蛋白峰。#p#分頁標題#e#
