(1)層析柱
實(shí)驗(yàn)室中所用的玻璃層析柱有兩種形式：一是下部帶有活塞的玻璃管，活塞的芯**好是聚四氟乙烯制作的，這樣可以不涂真空油脂，以免污染產(chǎn)品。如果使用普通的玻璃活塞，則真空油脂要小心地涂薄涂勻。另一種是將玻璃管下端拉細(xì)，套上一段彈性良好的管子。這段管子必須是不能被淋洗劑溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因?yàn)橄鹌ひ妆宦确?、苯、THF等溶劑溶脹，而聚乙烯管子對(duì)大多數(shù)溶劑是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夾控制流速，此外，薄膜塑料柱因使用方便、節(jié)省淋洗劑、減少蒸發(fā)量等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用日趨廣泛。薄膜塑料柱總是以扁平成卷保存的，兩側(cè)常有很深的折痕。使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊。將這段玻璃管穿過(guò)一個(gè)單孔塞。然后將薄膜管放進(jìn)一根又粗又長(zhǎng)，下端拉細(xì)了的玻璃管內(nèi)，使塞子塞緊大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內(nèi)部壓強(qiáng)大于外部而自行展圓。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個(gè)小孔即可使用。
層析柱的尺寸根據(jù)被分離物的量來(lái)確定，其直徑與高度之比則根據(jù)被分離混合物的分離難易而定，一般在1∶8到1∶50之間。柱身細(xì)長(zhǎng)，分離效果好，但可分離的量小，且分離所需時(shí)間長(zhǎng)；柱身短粗，分離效果較差，但一次可以分離較多的樣品，且所需時(shí)間短。如果待分離物各組分較難分離，宜選用細(xì)長(zhǎng)的柱子，如果要處理大量的較易分離的或?qū)Ψ蛛x純度要求較低的混合物，則可選用粗而短的柱子。**常使用的層析柱，直徑與長(zhǎng)度之比在1∶8 到1∶15 之間。 (2)吸附劑
柱層析中**常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠。其用量為被分離樣品的30～50倍，對(duì)于難以分離的混合物，吸附劑的用量可達(dá)100倍或更高。對(duì)于吸附劑應(yīng)綜合考慮其種類、酸堿性、粒度及活性等因素，**后用實(shí)驗(yàn)方法選擇和確定。 市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗到其浸出液的pH值為4，適用于分離酸性物質(zhì)；堿性氧化鋁浸出液的pH值為9～10，用以分離胺類、生物堿及其他有機(jī)堿性化合物。中性氧化鋁的相應(yīng)pH值為7.5，適合于醛、酮、醌、酯等類化合物的分離以及對(duì)酸、堿敏感的其他類型化合物的分離。硅膠沒(méi)有酸堿性之分，可適用于各類有機(jī)物的分離。
柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100～150目，硅膠為60～100目，如果顆粒太小，淋洗劑在其中流動(dòng)太慢，甚**流不出來(lái)。
氧化鋁和硅膠的活性各分五個(gè)等級(jí)。哪個(gè)活性級(jí)別分離效果**好，要用實(shí)驗(yàn)方法確定，而不是盲目選擇高的活性級(jí)別，**常使用的是Ⅱ～Ⅲ級(jí)。如果吸附劑活性太低，分離效果不好，可通過(guò)“活化”來(lái)提高其活性。所謂“活化”就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分，提高其吸附活性的過(guò)程。通常是將吸附劑裝在瓷盤里放進(jìn)烘箱中恒溫加熱。“活化”的溫度和時(shí)間應(yīng)根據(jù)分離需要而定。氧化鋁一般在200℃恒溫4h，硅膠在105～110℃恒溫0.5～1h。“活化”完畢，切斷電源，待溫度降**接近室溫時(shí)，從烘箱中取出放進(jìn)干燥器中備用。有的樣品在活性高的吸附劑中分離效果不好，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，分離效果反而好一些。
此外，一些天然產(chǎn)物帶有多種官能團(tuán)，對(duì)微弱的酸堿性都很敏感，則可用纖維素、淀粉或糖類作吸附劑?；钚蕴际且环N吸附能力很高的吸附劑，但因粒度太小而不常用。 (3)淋洗劑
淋洗劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來(lái)所用的溶劑，所以也稱為洗脫劑或簡(jiǎn)稱溶劑。其極性大小和對(duì)被分離物各組分的溶解度大小對(duì)于分離效果非常重要。如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)大于被分離物的極性，則淋洗劑將受到吸附劑的強(qiáng)烈吸附，從而將原來(lái)被吸附的待分離物“頂替”下來(lái)，隨多余的淋洗劑沖下而起不到分離作用；如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)小于各組分的極性，則各組分被吸附劑強(qiáng)烈吸附而留在固定相中，不能隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，也不能達(dá)到分離的目的。如果淋洗劑對(duì)于被分離物各組分溶解度太大，被分離物將會(huì)過(guò)多、過(guò)快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地分離；如果溶解度太小，則會(huì)造成譜帶分散，甚**完全不能分開。常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類不同而不盡相同，很多資料給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現(xiàn)出的極性次序，可作為選擇溶劑的參考，shou先在薄層層析板上試選，初步確定后再上柱分離。如果所有色帶都行進(jìn)甚慢則應(yīng)改用極性較大溶解性能也較大的溶劑，反之則改用極性和溶解性都較小的溶劑，直**獲得滿意的分離效果。
除了分離效果外還應(yīng)當(dāng)考慮：①在常溫**沸點(diǎn)的溫度范圍內(nèi)可與被分離物長(zhǎng)期共存不發(fā)生任何化學(xué)反應(yīng)，也不被吸附劑或被分離物催化而發(fā)生自身的化學(xué)反應(yīng)；②沸點(diǎn)較低以利回收；③毒性較小，操作安全；④適當(dāng)考慮價(jià)格是否合算，來(lái)源是否方便；⑤回收溶劑一般不應(yīng)作為**終純化產(chǎn)物的淋洗劑。 淋洗劑的用量往往較大，故**好使用單一溶劑以利回收。只有在選不出合適的單一溶劑時(shí)才使用混合溶劑。混合溶劑一般由兩種可以無(wú)限混溶的溶劑組成，先以不同的配比在薄層板上試驗(yàn)，選出**佳配比，再按該比例配制好，像單一溶劑一樣使用。如果必須在層析過(guò)程中改變淋洗劑的極性，不能把一種溶劑迅速換成另一種溶劑，而應(yīng)當(dāng)將極性稍大的溶劑按一定的百分率逐漸加到正在使用的溶劑中去，逐步提高其比例，直**所需要的配比。一條經(jīng)驗(yàn)規(guī)律稱為“冪指數(shù)增加”，例如，原淋洗劑為環(huán)己烷，如欲加入二氯甲烷以增加其極性，則不應(yīng)立即換為二氯甲烷，而應(yīng)使用這兩種溶劑的混合液，其中二氯甲烷的比例依次為5%，15%，45%，**后再換為純凈的二氯甲烷。每次加大比例后，須待流出液量為吸附劑裝載體積的3倍時(shí)再進(jìn)一步加大比例。這只是一般方法，其目的在于避免后面的色帶行進(jìn)過(guò)快，追上前面的色帶，造成交叉帶。但如果兩色帶間有很寬闊的空白帶，不會(huì)造成交叉，則亦可直接換成后一種溶劑，所以應(yīng)根據(jù)具體情況靈活運(yùn)用。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
(4)被分離的混合物
在實(shí)際工作中，被分離的樣品是不能選擇的，但認(rèn)真考察各個(gè)組分的分子結(jié)構(gòu)，估計(jì)其吸附能力，對(duì)于正確選擇吸附劑和淋洗劑都是有益的。若化合物的極性較大，或含有極性較大的基團(tuán)，則易被吸附而較難被洗脫，宜選用吸附力較弱的吸附劑和極性較大的淋洗劑。反之，對(duì)于極性較小的樣品則選用極性較強(qiáng)的吸附劑和弱極性或非極性淋洗劑。若各組分極性差別較大，則易于分離，可選用較為短粗的柱子，使用較少的吸附劑；若各組分極性相差甚微，則難于分離，宜選用細(xì)長(zhǎng)的柱子并使用較大量的吸附劑。
(5)其他物品
儲(chǔ)存淋洗劑的分液漏斗一只，接收洗出液的錐形瓶若干只，其容積大小根據(jù)淋洗劑的體積確定。玻璃毛少量，白沙少量，各自洗凈烘干。若層析柱很小，也可用少量脫脂棉代替玻璃毛。
2.吸附柱層析的操作
(1)裝柱
裝柱的方法分濕法和干法兩種。
濕法裝柱時(shí)，將柱豎直固定在鐵支架上，關(guān)閉活塞，加入選定的淋洗劑**柱容積的1/4 ，用一支干凈的玻璃棒將少量玻璃毛(或脫脂棉)輕輕推入柱底狹窄部位，小心擠出其中的氣泡，但不要壓得太緊密，否則淋洗劑將流出太慢或根本流不出來(lái)。將準(zhǔn)備好的白沙加入柱中，使在玻璃毛上均勻沉積成約5mm厚的一層。將需要量的吸附劑置燒杯中，加淋洗劑浸潤(rùn)，溶脹并調(diào)成糊狀。打開柱下活塞調(diào)節(jié)流出速度為每秒鐘1滴，將調(diào)好的吸附劑在攪拌下自柱頂緩緩注入柱中，同時(shí)用套有橡皮管的玻璃棒輕輕敲擊柱身，使吸附劑在淋洗劑中均勻沉降，形成均勻緊密的吸附劑柱。吸附劑**好一次加完。若分?jǐn)?shù)次加，則會(huì)沉積為數(shù)層，各層交接處的吸附劑顆粒甚細(xì)，在分離時(shí)易被誤認(rèn)為是一個(gè)色層。全部吸附劑加完后，在吸附劑沉積面上蓋一層白沙(如柱很小，也可不用白沙而蓋上一張直徑與柱內(nèi)徑相當(dāng)?shù)臑V紙片)，關(guān)閉活塞。在全部裝柱過(guò)程及裝完柱后，都需始終保持吸附劑上面有一段液柱，否則將會(huì)有空氣進(jìn)入吸附劑，在其中形成氣泡而影響分離效果。如果發(fā)現(xiàn)柱中已經(jīng)形成了氣泡，應(yīng)設(shè)法排除，若不能排除，則應(yīng)倒出重裝。裝好的吸附柱各層材料的分布見(jiàn)圖3-36。
干法裝柱時(shí)，先將柱豎直固定在鐵支架上，關(guān)閉活塞。加入溶劑**柱容積的3/4，打開活塞控制溶劑流速為1滴/秒，然后將所需量的吸附劑通過(guò)一支短頸玻璃漏斗慢慢加入柱中，同時(shí)，輕輕敲柱身使柱填充緊密。干法裝柱的缺點(diǎn)是容易使柱中混有氣泡。特別是使用硅膠為吸附劑時(shí)，**好不用干法裝柱，因?yàn)楣枘z在溶劑中有一溶脹過(guò)程，若采用干法裝柱，硅膠會(huì)在柱中溶脹，往往留下縫隙和氣泡，影響分離效果，甚**需要重新裝柱。
裝填薄膜塑料柱時(shí)，可先用抽氣法將薄膜展開成圓柱形，在底部裝入一段玻璃毛，吸附劑通過(guò)一個(gè)粗頸漏斗自柱頂裝入。裝**1/3處，將柱身在堅(jiān)硬的表面上礅結(jié)實(shí)，再裝入1/3，再礅結(jié)實(shí)，直**裝到需要的高度。裝成的薄膜柱應(yīng)緊密結(jié)實(shí)，可以像玻璃柱那樣用夾子夾住，再在其底部扎一些小孔即可使用。(2)加樣
加樣亦有干法、濕法兩種。濕法加樣是將待分離物溶于盡可能少的溶劑中，如有不溶性雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)濾去。打開柱下活塞小心放出柱中液體**液面下降到濾紙片處，關(guān)閉活塞，將配好的溶液沿著柱內(nèi)壁緩緩加入，切記勿沖動(dòng)吸附劑，否則將造成吸附劑表面不平而影響分離效果。溶液加完后，小心開啟柱下活塞，放出液體**溶液液面降**濾紙片時(shí)，關(guān)閉活塞，用少許溶劑沖洗柱內(nèi)壁(同樣不可沖動(dòng)吸附劑)，再放出液體**液面降到濾紙?zhí)?，再次沖洗柱內(nèi)壁，直**柱壁和柱頂溶劑沒(méi)有顏色。加樣操作的關(guān)鍵是要避免樣品溶液被沖稀。在技術(shù)熟練的情況下，也可以不關(guān)下部活塞，在每秒鐘1滴的恒定流速下連貫地完成上述操作。
干法加樣是將待分離樣品加少量低沸點(diǎn)溶劑溶解，再加入約5倍量吸附劑，拌和均勻后在通風(fēng)櫥中蒸發(fā)**干。揭去柱頂濾紙片，將吸附了樣品的吸附劑平攤在柱內(nèi)吸附劑的頂端，在上面加蓋濾紙片或加蓋一層白沙。干法加樣易于掌握，不會(huì)造成樣品溶液的沖稀，但不適合對(duì)熱敏感的化合物。
(3)淋洗和接收
樣品加入后即可用大量淋洗劑淋洗。隨著流動(dòng)相向下移動(dòng)，混合物逐漸分成若干個(gè)不同的色帶，繼續(xù)淋洗，各色帶間距離拉開，**終被一個(gè)個(gè)淋洗下來(lái)。當(dāng)**色帶開始流出時(shí)，更換接收瓶，接收完畢再更換接受瓶，接受兩色帶間的空白帶，并依此法分別接收各個(gè)色帶。若后面的色帶下行太慢，可依次使用幾種極性逐漸增大的淋洗劑來(lái)淋洗。為了減少添加淋洗劑的次數(shù)，可用分液漏斗在柱頂“自動(dòng)”添加。分液漏斗的活塞打開，頂塞密封，尾部插進(jìn)柱上部的淋洗劑液面以下，當(dāng)液面下降后，漏斗尾部露出，即有空氣泡自尾部進(jìn)入分液漏斗，這就加大了漏斗內(nèi)液面上的壓力，漏斗內(nèi)的淋洗劑就自動(dòng)流入柱內(nèi)，使柱內(nèi)液面上升，當(dāng)液面淹沒(méi)漏斗尾部時(shí)，就不再有空氣進(jìn)入漏斗，漏斗內(nèi)的淋洗劑就不再流出。在使用薄膜塑料柱進(jìn)行層析時(shí)，一旦色帶形成并拉開距離，可將柱吸干，用刀沿“空白帶”處切開，將各色帶分別萃取，各自蒸去溶劑，即得到相應(yīng)組分的化合物。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
(4)顯色
分離無(wú)色物質(zhì)時(shí)需要顯色。如果使用帶螢光的吸附劑，可在黑暗的環(huán)境中用紫外光照射以顯出各色帶的位置，以便按色帶分別接收。但柱上顯色遠(yuǎn)不如在薄層板上顯色方便。所以常用的辦法是等分接收，即事先準(zhǔn)備十幾個(gè)甚**幾十個(gè)接收瓶，依次編出號(hào)碼，各接收相同體積的流出液，并各自在薄層板上點(diǎn)樣展開，然后在薄層板上顯色(相關(guān)的顯色操作見(jiàn)薄層層析部分)。具有相同Rｆ值的為同一組分，可以合并處理。也可能出現(xiàn)交叉帶，若交叉帶很少，可以棄之，若交叉帶較多，或樣品很貴重，可以將交叉部分再次作柱層析分離，直**完全分開。
3.柱層析操作中應(yīng)注意的問(wèn)題
(1)要控制淋洗劑流出的速度。一般控制流速為1滴/秒。若流速太快，樣品在柱中的吸附和溶解過(guò)程來(lái)不及達(dá)到平衡，影響分離效果。若流速太慢，分離時(shí)間會(huì)拖得太長(zhǎng)。有時(shí)，樣品在柱中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能促成某些成分發(fā)生變化?；蛄鲃?dòng)相在柱中下行速度小于樣品的擴(kuò)散速度，會(huì)造成色帶加寬、交合甚**根本不能分離。
(2)以下現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重影響分離效果，必須盡力避免。
a.色帶過(guò)寬，界限不清。造成的原因可能是柱的直徑與高度比選擇不當(dāng)，或吸附劑、淋洗劑選擇不當(dāng)，或樣品在柱中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。但更常見(jiàn)的卻是在加樣時(shí)造成的。若在樣品溶液加進(jìn)柱中后，沒(méi)有打開下部活塞放出淋洗劑使樣品溶液降**濾紙片處，即急于加溶劑沖洗柱壁，造成樣品溶液大幅度稀釋，或過(guò)早加大量溶劑淋洗，必然會(huì)造成色帶過(guò)寬。所以溶樣時(shí)一定要使用盡可能少的溶劑，加樣時(shí)一定要避免樣品溶液的稀釋。
b.色帶傾斜。正常情況下柱中的色帶應(yīng)是水平的，而傾斜的色帶，在前一個(gè)色帶尚未完全流出時(shí)，后面色帶的前沿已開始流出，所以不能接收到純粹的單一組分。造成色帶傾斜的原因是吸附劑的頂面裝得傾斜，或柱身安裝得不垂直。
c.氣泡。造成氣泡的原因可能是玻璃毛或脫脂棉中的空氣未擠凈，其后升入吸附劑中形成氣泡，也可能是吸附劑未充分浸潤(rùn)溶脹，在柱中與淋洗劑作用發(fā)熱而形成，但更大量的是在裝柱或淋洗過(guò)程中淋洗劑放出過(guò)快，液面下降到吸附劑沉積面之下，使空氣進(jìn)入吸附劑內(nèi)部滯留而成。當(dāng)柱內(nèi)有氣泡時(shí)，大量淋洗劑順氣泡外壁流下，在氣泡下方形成溝流，使后一色帶前沿的一部分突出伸入前一色帶，從而使兩色帶難于分離。所以在裝柱及淋洗過(guò)程中應(yīng)始終保持吸附劑上面有一段液柱。
d.柱頂面填裝不平。這時(shí)色帶前沿將沿低凹處向下延伸進(jìn)入前面的色帶，這也是一種溝流。
e.斷層和裂縫。當(dāng)柱內(nèi)某一區(qū)域內(nèi)積有較多氣泡時(shí)，這些氣泡會(huì)合并起來(lái)在柱內(nèi)形成斷層或裂縫。裂縫造成的溝流，而斷層相當(dāng)于一個(gè)不平整的裝載面。
